Strukturelle und funktionelle Charakterisierung der Protease CT441 aus Chlamydia trachomatis

Das Gram-negative, obligat-intrazelluläre Bakterium Chlamydia trachomatis ist der Haupterreger bakteriell verursachter, vermeidbarer Erblindungserkrankungen, sowie der Infektion des Urogenitaltraktes. Chlamydien durchlaufen während der Infektion der Wirtszelle einen komplexen Infektionszyklus, wobei bisher nicht alle molekularen Details verstanden sind. Es ist bekannt, dass für die Etablierung und Manifestierung der Infektion chlamydiale Effektorproteine, die in das Zytoplasma der Wirtszelle sekretiert werden, eine wichtige Rolle einnehmen. Im Fokus dieser Arbeit stand die Serinprotease CT441 aus Chlamydia trachomatis, eine sogenannte tail specific protease (Tsp), für die eine mögliche Beteiligung an der Modulation der Immunantwort des Wirtes und hormoneller Signalwege vermutet wird. Da bisher nur unzureichende Informationen bezüglich der molekularen Funktion von CT441 verfügbar sind und keine Proteinstruktur verfügbar war, stellte die Aufklärung der drei-dimensionalen Proteinstruktur mit Hilfe der Röntgenkristallographie ein primäres Ziel dieser Arbeit dar. Die Analyse gewonnener Diffraktionsdaten ermöglichte erstmals die nahezu vollständige Bestimmung der dreidimensionalen Struktur und zeigt, dass CT441 aus drei Domänen aufgebaut ist. CT441 weist N-terminal eine bisher einzigartige Domäne (NTD) auf. Ein Sekundärstruktur-Alignment der NTD mit Tsps anderer Gram-negativer Pathogene weist auf eine neue, womöglich weit verbreitete, bisher jedoch nicht beschriebene Domäne hin. Erste Hinweise auf eine mögliche Funktion der NTD liefern die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse. Es konnte die Vermittlung der Löslichkeit des Gesamtproteins während der Proteinherstellung sowie eine mögliche Beteiligung an der erstmals identifizierten Chaperonaktivität von CT441 beobachtet werden. Die detaillierte Analyse der CT441-Struktur führte zudem zur Identifikation einer, in der Cterminalen Domäne (CTD) lokalisierten, katalytischen Triade im aktiven Zentrum. Bisher wurde davon ausgegangen, dass CT441 eine katalytische Diade, bestehend aus den Aminosäureresten S455 und K481, in der CTD besitzt. Proteinaktivitätstests unter Verwendung strukturbasierter CT441-Mutanten führten zur Identifikation von Q485 als zusätzlichen essentiellen Aminosäurerest für die proteolytische Aktivität. Struktur- und Sequenzvergleiche mit Tsps aus Prokaryoten und Eukaryoten bestätigten zudem die in dieser Arbeit beschriebene katalytische Ser/Lys/Gln-Triade als weit verbreitetes Charakteristikum der Tsps. Biochemische Analysen führten außerdem zur Entdeckung einer von der Proteasefunktion unabhängigen Chaperonaktivität, die eine mögliche bisher unbekannte zusätzliche Funktion von CT441 in der bakteriellen Proteinqualitätskontrolle vermuten lässt. Ein weiterer Aspekt dieser interdisziplinären Arbeit war die Analyse der Interaktion von CT441 mit SRAP1, einem zellulären Co-Aktivator des Östrogenrezeptors α (ERα) im Kontext der Infektion humaner Zellen. Hierbei zeigte sich, dass im Gegensatz zu bisher veröffentlichten Daten in vitro eine Spaltung von SRAP1 durch CT441 hervorgerufen wird. Biochemische Untersuchungen und visuelle Analysen mit Hilfe der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie zeigten, dass in Infektionsexperimenten mittels Zellkultur eine Interaktion von CT441 und SRAP1 vermutlich erst nach der Lyse der chlamydialen Inklusion in der späten Phase des Infektionszyklus auftritt. Es konnte keine aktive Translokation von CT441 in das Wirtszell-Zytoplasma im Verlauf der Infektion vor der Lyse der Inklusionsmembran beobachtet werden. Daher ist basierend auf den in dieser Arbeit gewonnenen Daten, in vivo eine Beteiligung von CT441 an der Modulation zellulärer Signalwege nicht eindeutig verifizierbar. Die erstmalig in dieser Arbeit bestimmte Proteinstruktur von CT441, einschließlich der begonnenen funktionellen Charakterisierung, kann als Basis für vielfältige zukünftige Studien zur Entwicklung neuer, strukturbasierter antichlamydialer Verbindungen und zur Charakterisierung der in anderen bakteriellen Pathogenen vorkommenden Tsps dienen.