Protein dynamics and substrate recognition of human blood group glycosyltransferases

It is now recognized that human blood group glycosyltransferases A (GTA) and B (GTB) are under allosteric control of donor and acceptor substrates. Based on our previous findings, we advance the hypothesis that this allosteric control can only be fully understood when a causative connection to protein dynamics is made. Therefore, we suggest studying the protein dynamics of GTA and GTB employing NMR experiments. In parallel, we will resume isothermal titration calorimetry (ITC) experiments using novel inhibitors that interfere with the loop movement of GTA and GTB. Because of the size (70 kDa) of the target proteins we will focus on 13C-methyl labeling techniques and methyl-TROSY based NMR experiments. We will link NMR data on protein dynamics with thermodynamic data to test our hypothesis and uncover novel principles of how human blood group glycosyltransferases operate.

Die NMR-spektroskopischen Studien an den humanen Blutgruppe A und B Glycosyltransferasen GTA und GTB haben zu einem Verständnis der allosterischen Regulierung dieser Enzyme durch Modulierung von Dissoziations- und Assoziationsgeschwindigkeitskonstanten geführt. Hieraus lassen sich interessante mechanistische Schlussfolgerungen ziehen. Beispielsweise sollte nach unseren Ergebnissen die Spezifität der Enzyme für verschiedene Blutgruppentypen in vivo davon abhängen, ob die sogenannte Donorroute oder die Akzeptorroute eingeschlagen wird. Dies wiederum hängt von den Konzentrationsverhältnissen der Akzeptor- und Donorsubstrate im entsprechenden Kompartiment in der Zelle (hier: Golgi-Apparat) ab. So kann also die Biosynthese von Blutgruppenantigenen vom Typ 1 bis zum Typ 6 über Konzentrationsverhältnisse von Substraten geregelt werden. Die ermittelten Dissoziations- und Assoziationsgeschwindigkeitskonstanten geben indirekt auch Auskunft über die dem Glycosyltransfer zugrunde liegende Proteindynamik. Die Dissoziationsgeschwindigkeitskonstanten stellen eine natürliche Untergrenze für die Übergänge zwischen der offenen, der halbgeschlossenen und der geschlossenen Konformation dar. Überraschend war die Beobachtung, dass GTA und GTB im apo-Zustand wie auch in den Substrat-gesättigten Formen keine nennenswerte Relaxationsdispersion zeigten. Da andererseits sowohl in den Backbone TROSY HSQC wie auch in den Methyl TROSY Spektren nur ein Satz von Kreuzsignalen beobachtet wird, können langsame Konformationsumwandlungen ausgeschlossen werden. Folglich können die beobachteten Konformationsumwandlungen nur durch Bindung an Substrate hervorgerufen werden. Damit grenzen sich diese Glycosyltransferasen gegen andere Enzyme wie etwa Cyclophilin A mechanistisch ab. Methodisch konnte gezeigt werden, dass Methyl TROSY basierte Techniken für die NMR- spektroskopische Untersuchung von Glycosyltransferasen hervorragend geeignet sind. Es wird sicher interessant sein, mit diesen "Werkzeugen" weitere Glycosyltransferasen zu untersuchen. Insbesondere eröffnen die beschriebenen Experimente neue Perspektiven für die Entwicklung von Glycosyltransferaseinhibitoren - von denen es nach wie vor kaum brauchbare Prototypen gibt. Beispielsweise ist denkbar, dass die Optimierung einer Leitstruktur nicht nur auf die Messung von Dissoziationskonstanten zurückgreift, sondern gleichzeitig die Assoziations-/Dissoziationskinetik in Betracht zieht.