Kdo activation and transfer in A. aeolicus

Die innerhalb der Gram-negativen Bakterien hochkonservierte 3-Desoxy-D-manno-oct-2ulosonsäure (Kdo) verbindet die Lipoid A-Region mit der Polysaccharidkette des Lipopolysaccharids (LPS). Aufgrund ihrer nahezu unentbehrlichen Rolle für die Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität und Lebensfähigkeit der bakteriellen Zelle sind die Enzyme der Kdo-Biosynthese, der Kdo-Aktivierung und des Kdo-Transfers attraktive Angriffsziele für die Entwicklung einer neuen Generation von Antibiotika. In dem beantragten Forschungsvorhaben sollen die LPS-spezifische CMP-Kdo-Synthetase für die Kdo-Aktivierung und die Kdo-Transferase des hyperthermophilen Aquifex aeolicus erstmalig strukturell in Verbindung mit einer funktionellen Charakterisierung durch den Einsatz verschiedenster Substrate, Substrat- und Produktanaloga sowie potentieller Inhibitoren untersucht werden. Darüber hinaus wird das Projekt neue Erkenntisse über die Evolution beider Enzyme und die molekularen Ursachen der einzigartigen Multifunktionalität der Kdo-Transferasen erbringen.

Lipopolysaccharide (LPS) sind charakteristische und essentielle Bestandteile der äusseren Membran Gram-negativer Bakterien. Als Membran-assoziierte und exponierte Moleküle spielen sie eine entscheidende Rolle für ein breites Spektrum physiologischer Aktivitäten, die das Wachstum und Überleben der Bakterien gewährleisten. Die innerhalb der Gram-negativen Bakterien hochkonservierte 3-Desoxy-D-manno-oct-2-ulosonsäure (Kdo) verbindet die sogenannte Lipoid A-Region mit der Polysaccharidkette des LPS und ist massgeblich an der Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität und Lebensfähigkeit der bakteriellen Zelle beteiligt, so dass eine Inaktivierung der Enzyme des Kdo-Biosyntheseweges in der Regel lethal für die Zelle ist. Somit ist die Entwicklung einer neuen Generation von Antibiotika gegen die einzelnen biosynthetischen Schritte des Kdo-Weges von grossem Interesse, setzt aber ein tiefgreifendes Verständnis der Reaktionsmechanismen auf molekularer Ebene voraus. Wir haben deshalb in dem durch die DFG geförderten Projekt die CMP- Kdo-Synthetase KdsB und die Kdo-Transferase WaaA aus dem hyperthermophilen, Gram-negativen Bakterium Aquifex aeolicus als Modelle für die letzten beiden Schritte des Kdo-Biosyntheseweges, der Aktivierung von Kdo zu CMP-Kdo und des Transfers von Kdo vom CMP-Kdo auf den Lipoid A-Teil, funktionell und strukturell untersucht. Anhand der Identifizierung eines einzigen Kdo-Restes in der inneren Kernregion des LPS aus A. aeolicus und von Kdo-Lipoid IVA in einem neuen, für die in-vivo-Charakterisierung des waaA-Gens aus A. aeolicus und anderer heterologer Kdo-Transferasen konstruierten E. coli dwaaA Suppressor-Stammes, sowie durch den Nachweis des Transfers eines einzigen Kdo-Zuckers auf eine Reihe unterschiedlich acylierter und geladener Lipoid A-Akzeptoren in vitro, konnten wir den Beweis erbringen, dass WaaA aus A. aeolicus zur Gruppe der monofunktionellen Kdo-Transferasen gehört, wobei aus Bindungsstudien von Kdo, CMP und anderen Nukleotidmonophosphaten an das Enzym die Schlussfolgerung einer spezifischen, CMP-vermittelten Wechselwirkung von CMP-Kdo an WaaA gezogen werden konnte. Im Rahmen des Projektes wurde zum ersten Mal die Kristallstruktur einer Kdo-Transferase weitestgehend aufgeklärt. Als Vertreter der sogenannten Glycosyltransferasefamilie B zeigt das WaaA-Molekül aus A. aeolicus den für diese Familie typischen Aufbau aus einer N- und C-terminalen Domäne, die beide ein zentrales, paralleles ß-Faltblatt, umgeben von mehreren a- Helices, enthalten. Das WaaA-Molekül konnte als Dimer identifiziert werden, wobei sich die Dimerisierungsregion in der N-terminalen Domaine befindet. Desweiteren konnte die Kristallstruktur der LPS-spezifischen CMP-Kdo-Synthetase des hyperthermophilen Bakteriums im Komplex mit dem CTP-Substrat gelöst werden. Während die Bindung von CTP-Mg2+ im N-terminalen Bereich des Homodimers erfolgt, ist der C-terminale Bereich für die Homodimerisierung verantwortlich. Ein Monomer besteht aus einem zentralen, 9-strängigen ß-Faltblatt, welches von 8 a-Helices umgeben ist. Auf der Grundlage detailierter Analysen der konservierten KdsB-Struktur schlagen wir einen „Zwei- Mg2+-Ionen-Mechanismus“ für die Synthetase-katalysierte Reaktion der Kdo-Aktivierung zu CMP-Kdo vor.