Effekt von Mutationen in VPS35 auf humane dopaminerge Neurone

Dem beantragten Projekt liegt die Hypothese zugrunde, dass die Störung zellulärer Transportmechanismen eine Schlüsselrolle bei der Pathogenese des Morbus Parkinson (MP) spielt, und dass diese generelle Schädigung einen stärkeren Effekt bei gefährdeteren Zellen hat. MP ist die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung und pathologisch assoziiert mit dem Sterben der dopaminergen Neurone im Mittelhirn. Diese Neurone sind durch eine besondere anatomische Komplexität charakterisiert, die intensive Transportprozesse erfordert und dadurch mit einer größeren bioenergetischen Nachfrage verbunden ist, die die Zellen besonders anfällig für Stress machen könnte. Mutationen in dem Gen vacuolar protein sorting 35 (VPS35) wurden kürzlich mit dominant vererbtem MP in Verbindung gebracht, einer seltenen monogenetischen Form, die klinisch nicht zu unterscheiden ist vom idiopathischen MP. Für VPS35 wurde bereits gezeigt, dass es die Sortierung und den Abbau von Vesikeln reguliert. In einer gemeinsamen Studie zwischen dem Antragsteller und dem Labor des hier ausgewählten Gastinstituts haben wir gezeigt, dass VPS35 Neurotransmitterrezeptoren bindet, den Transport steuert und damit Einfluss nimmt auf die Oberflächenexpression und Funktion. Im Rahmen des vorliegenden Projekts soll unter Verwendung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) ein humanes neuronales Zellmodell mit endogener VPS35-Mutation etabliert und charakterisiert werden, um den Einfluss der Mutation zu untersuchen. Es werden die folgenden drei spezifischen Ziele bearbeitet: (i) Etablierung einer Zellkultur mit humanen dopaminergen Neuronen differenziert aus iPS-Zelllinien (von Patienten und isogenen Kontrollen) und geeignet für Live-Cell-Versuche. Diese Kultur wird ausgereifte, identifizierbare dopaminerge Neurone in Kokultur mit erregenden kortikalen Neuronen enthalten. (ii) Untersuchung dieser Neurone auf morphologische und elektrophysiologische Effekte. Axonale Verzweigung und Neuritenwachstum von dopaminergen Neuronen wird mittels konfokalen Mikroskops bestimmt, und intrinsische Erregbarkeit, Kanalfunktion, sowie Aktionspotentiale werden mittels Patch-Clamp-Technik gemessen. (iii) Basale und pharmakologisch stimulierte Dopamin-Freisetzung wird über HPLC analysiert. Zusätzlich zu neuen pathophysiologischen Einblicken in den MP wird der Wert dieses Projekts in einem umfangreich charakterisierten, einzigartigen humanen Krankheitsmodell bestehen, das in hohem Maße zugänglich für experimentelle Manipulationen ist und verfügbar wäre für die Testung neuer Wirkstoffe.

The present study demonstrates the successful generation of a new tool to identify living dopaminergic (DA) neurons, the affected cell type in Parkinson disease, and the examination of DA release and stress susceptibility in VPS35 mutant DA neurons. The p.D620N missense mutation in vacuolar protein sorting 35 (VPS35) has been recently linked to dominantly inherited parkinsonism. 1.) A GFP reporter sequence was put under the control of the GIRK2 promoter in a lentiviral vector that enables the identification of living neurons positive for the DA marker tyrosine hydroxylase. These iPSC-derived neurons were analyzed for their ability to fire action potentials by patch clamp electrophysiology. Neurobiotin pipette filling during patching and tyrosine hydroxylase immunofluorescence staining post-fixation confirmed the identity of the examined neurons. 2.) DA neurons were differentiated from isogenic VPS35 wild-type and p.D620N mutant iPSC lines. DA release was markedly increased by KCl-induced membrane depolarization in wild-type but only to a minor degree in p.D620N lines. Further, treatment with the dopamine transporter inhibitor GBR 12909 resulted in increased DA levels in wild-type but not p.D620N neurons. Impaired synaptic neuroreceptor trafficking might cause the observed reduction in DA release and could possibly also affect DA uptake. This might produce chronic pathophysiological stress upon the neurons that need to compensate for the dysfunctional DA release. In-line with this hypothesis is the observation of increased susceptibility to MPP+ mitochondrial toxin found in VPS35 mutant neurons. Degeneration of DA neurons plays an important role in Parkinson disease and there is, therefore, a great need for studies in the affected cell type. We intend to further validate our findings and examine the DA metabolism and electrophysiological characteristics in VPS35 mutant neurons.