DFG Major Research Instrumentation: Multiphoton Microscope

Two multiphoton microscopes are already being used at the University of Lübeck as part of various third-party funded projects and both animal and cell culture models are being analysed using this technology. There is also a great deal of expertise in the further development of multiphoton microscopy and optical coherence tomography as well as laser-assisted cell manipulation. In recent years, however, multiphoton microscopy has developed considerably in terms of equipment and the equipment/technology of the two existing devices is no longer sufficient to answer the questions posed by the applicants, most of which are externally funded. There is an urgent need for a new microscope with the following additional features: simultaneous use of three excitation wavelengths, line-by-line switching of excitation wavelengths, high sensitivity of the detectors, long-term stability of the setup for intravital imaging, measurement of the fluorescence lifetime of NADPH in combination with visualisation of other fluorophores, adaptive optics and integration of optical coherence tomography and cell manipulation.

Prozesse im Körper sind dynamisch und können besser verstanden werden, wenn man sie zeitaufgelöst mit mikroskopischer Auflösung sichtbar macht. Die Multiphotonenmikroskopie ist eine gewebeschonende Methode, um Fluoreszenzfarbstoffe im lebenden Gewebe darzustellen. Hierbei können bereits im Gewebe vorhandene Fluoreszenzfarbstoffe, genetisch exprimierte Fluoreszenzfarbstoffe oder extern zugegebene Fluoreszenzfarbstoffe genutzt werden. Farbstoffe können entweder zur gezielten Markierung von Zellen verwendet werden, sie können aber auch genutzt werden, um Prozesse, wie zum Beispiel die Aktivität von Enzymen, sichtbar zu machen. Die Möglichkeit des Multiphotonenmikroskops, endogene Fluoreszenzfarbstoffe für die Bildgebung zu verwenden, wurde genutzt, um Zellen des Immunsystems in den Atemwegen sichtbar zu machen und deren Dynamik zu analysieren. Hierbei zeigte sich, dass die Verwendung von Autofluoreszenz einen zwar sehr guten Überblick über die Gewebemorphologie sowohl in Maus als auch in humanen Geweben gibt, aber nicht alle Zelltypen sicher visualisiert. Die Kombination der Autofluoreszenz mit fluoreszierenden Antikörpern und/oder funktionellen Farbstoffen erlaubt dann die genauere Identifikation von Zellen anhand ihrer Oberflächenmarker sowie deren Aktivität im Gewebeverbund. Der zur Bildgebung verwendete Femtosekunden-Laser kann auch zur gezielten Zellchirurgie verwendet werden. Welche physikalischen Mechanismen hierbei eine Rolle spielen und wie diese sich von Zellchirurgie mit UV-Lasern oder Lasern im sichtbaren Bereich unterscheiden, ist Gegenstand aktueller Forschung. Autofluoreszenzbasierte Bildgebung in Kombination mit der Möglichkeit, durch Laserbeschuss einzelne Zellen aus dem Gewebeverband zu zerstören, wurde genutzt, um die Reparatur kleiner Epithelschäden in den Atemwegen über die Zeit zu verfolgen. Bei diesen Untersuchungen zeigte sich, dass sich Schäden von bis zu sechs benachbarten Zellen innerhalb von sechs Stunden durch Verformung von benachbarten Zellen schließen, größere Schäden aber häufig nicht im Beobachtungszeitraum verschlossen wurden und längere Zeit Eintrittspforte von Erregern oder Allergenen darstellen. Die Möglichkeit, die zelluläre Reaktion auf gezielte Gewebeschäden zu untersuchen, wurde auch genutzt, um das Verhalten von neutrophilen Granulozyten im Rahmen einer blasenbildenen Autoimmunerkrankung der Haut besser zu verstehen. Durch gezielte kleine Läsionen im Gewebe konnte gezeigt werden, dass das Vorhandensein von an ein Hautantigen gebundenen Autoantikörpern den Weg der neutrophilen Granulozyten zur Läsion verlangsamen. Gleichzeitig konnte mittels eines Reporterfarbstoffs in lebenden Mäusen nachgewiesen werden, dass es bei Bindung an die Antikörper-Antigenkomplexe zu einer gesteigerten Aktivität des gewebezerstörenden Enzyms neutrophile Elastase kommt. Verhindert man die Integrin-vermittelte Bindung der neutrophilen Granulozyten an die Antikörper-Antigenkomplexe, wird auch die Aktivität der neutrophilen Elastase reduziert und die Gewebezerstörung verhindert. Um weitere Einblicke in die Pathomechanismen von blasenbildenden Autoimmundermatosen zu bekommen, wurden verschiedene Reportermäuse verwendet, in denen bestimmte Zelltypen fluoreszierende Proteine exprimieren. In diesen Untersuchungen zeigte sich, dass neben neutrophilen Granulozyten auch eingewanderte Monozyten eine wichtige Rolle spielen könnten. Dieses Modell lässt sich auch nutzen, um die Wirkung von exogenen Substanzen auf die Immunantwort in der Haut zu untersuchen. So konnte auch gezeigt werden, dass die Protease Papain, die in Hautpflegeprodukten vorhanden sein kann, zu einer Rekrutierung von neutrophilen Granulozyten in die Haut führt. Zukünftige Forschungsansätze werden davon profitieren, dass die Multiphotonenmikroskopie mit anderen bildgebenden Verfahren kombiniert wird, um ein vollständigeres Bild der zellulären und molekularen Prozesse zu bekommen. Erste Ergebnisse zeigen, dass die Kombination mit optischer Kohärenztomographie (OCT) weitere Einblicke in die Gewebemorphologie bieten kann. Weitere Untersuchungen haben auch zeigen können, dass Nanopartikel für Magnetic Particle Imaging auch ein starkes Dreiphotonensignal erzeugen, was eine Untersuchung mit beiden Techniken erlaubt. Insgesamt streben wir an, die multimodale Bildgebung weiter zu verbessern, und für weitere biologische Fragestellung nutzbar zu machen.