DFG Major Research Instrumentation: HPLC/ESI Ion Trap Mass Spectrometer

The device is used for protein measurements to determine the crystal structure of proteins.
These proteins may need to be modified. One type of modification is the incorporation of selenomethionine instead of the naturally occurring amino acid methionine into the protein to be analysed. In order to measure the degree of incorporation of selenomethionine, various test proteins (cytochrome c, ovalbumin, lysozyme, clostripain, carbonic anhydrase) were initially measured to establish the measurement procedure. From the measurements of the natural and the selenomethionine-modified protein HtrA, an oligomeric serine protease, the incorporation of 7 selenomethionine residues into the protein could be determined. Since the protein sequence contains only 7 methionine residues, a complete incorporation of selenomethionine residues could be confirmed. The molar mass of other proteins being worked on at the institute, such as a protease from the St. Louis encephalitis virus (SLEV), was also routinely determined.

Inhibitors: Structure-based antiviral lead compounds are routinely analysed with the ESI-MS device with regard to their molecular size. The measurements are usually carried out using the positive-mode method, for some compounds also using the negative-mode method. In most cases, MS/MS spectra of the compounds are also measured to determine the structure more precisely. The target molecules against which these lead compounds are directed are essentially non-structural proteins (Nsps) from pathogenic RNA viruses such as SARS-CoV, West Nile virus, Chikungunya virus, Coxsackievirus and other enteroviruses. The 3C proteases from these viruses are used as the main target proteins. The synthesised lead compounds belong chemically to the group of Michael acceptors, benzotriazol esters, peptide aldehydes, benzanilides and substituted pyrroles. A total of more than 300 compounds and their precursors were measured. Of these, around 120 substances are intended for patenting.

Nano-LC measurements: Tryptic digested proteins were separated using nano-HPLC and analysed using the ESI-MS device. The samples analysed were mainly proteins that play a role in the infection or inflammation process, such as RelA (which plays a role in the adaptation of the prokaryotic metabolism and its gene expression to environmental changes and acts as a virulence factor), CPAF (a chlamydial protease), two fragments of DegQ (a chaperone protease from the periplasm of Legionella micdadei), PfICP (a cysteine protease inhibitor from Plasmodium falciparum) and the C- and N-terminal domain of the Mip protein (macrophage infectivity potentiator, an essential virulence factor) from Legionella and Chlamydia. As these proteins are partially unstable, in addition to the native proteins, degradation products were also investigated in order to characterise the degradation more precisely (C-terminal, N-terminal or interfaces within the protein). Furthermore, domain boundaries were also determined using ESI-MS. In some cases, the sequence coverage reached values of over 60%, which enabled unambiguous identification.

In collaboration with the Institute of Chemistry, the molecular weight of the peracetylated sugar 2-deoxy-2-N-13C-acetyl- 1,3,4,6-tetra-O-acetyl-ß-D glucopyranose and its precursors was analysed. Furthermore, investigations were carried out on the dimerisation of the galactosyltransferases GTA and GTB and the size of domain A2 of the von Willebrand factor was determined in collaboration with Prof. Karsten Seeger.

Department of Dermatology and Venereology: In collaboration with Prof Ralf Ludwig, the size of proteins involved in immunomodulation was measured. i

Institute of Physics: In collaboration with Prof. Dr Christian Hübner, the size of various fluorescence-labelled proteins was determined.

Institute of Medical Microbiology and Hygiene: In collaboration with Prof. Dr Jan Rupp, an attempt was made to identify proteins in the inclusion membrane of chlamydiae.

Messungen von Proben aus dem Institut für Biochemie, Universität Lübeck: a) Proteinmessungen: Um die Kristallstruktur von Proteinen bestimmen zu können, müssen diese ggf. modifiziert werden. Eine Modifizierungsart ist der Einbau von Selenomethionin anstatt der natürlich vorkommenden Aminosäure Methionin in das zu untersuchende Protein. Um den Grad des Einbaus von Selenomethionin zu messen, wurden zunächst zur Etablierung des Messverfahrens verschiedene Testproteine gemessen (Cytochrom c, Ovalbumin, Lysozym, Clostripain, Carboanhydrase). Aus den Messungen des natürlichen und des mit Selenomethionin modifizierten Proteins HtrA, einer oligomeren Serinprotease, konnte der Einbau von 7 Selenomethioninresten in das Protein bestimmt werden. Da die Proteinsequenz nur 7 Methioninreste enthält, konnte somit ein vollständiger Einbau von Selenomethioninresten bestätigt werden. Routinemäßig wurde auch die Molmasse weiterer Proteine, an denen im Institut gearbeitet wird, wie zum Beispiel einer Protease aus dem St. Louis Encephalitis Virus (SLEV), bestimmt. b) Inhibitoren: Struktur-basierte antivirale Leitverbindungen werden mit dem ESI-MS-Gerät routinemäßig in Hinblick auf ihre Molekülgröße überprüft. Die Messungen erfolgen dabei im Regelfall im positiv-mode-, für einigeVerbindungen auch im negativ-mode-Meßverfahren. Zur genaueren Strukturbestimmung werden in den meisten Fällen auch MS/MS-Spektren der Verbindungen gemessen. Bei den Targetmolekülen, gegen welche diese Leitverbindungen gerichtet sind, handelt es sich im wesentlichen um nicht-strukturelle Proteine (Nsps) aus pathogenen RNA-Viren wie etwa SARS-CoV, West-Nile Virus, Chikungunya-Virus, Coxsackievirus und andre Enteroviren. Als Hauptzielproteine werden die 3C-Proteasen aus diesen Viren benutzt. Die synthetisierten Leitverbindungen gehören chemisch zur Gruppe der Michael-Akzeptoren, Benzotriazolester, Peptidaldehyde, Benzanilide sowie substituierter Pyrrole. Insgesamt wurden mehr als 300 Verbindungen und deren Vorstufen gemessen. Von diesen sind etwa 120 Substanzen für eine Patentierung vorgesehen. c) Nano-LC-Messungen: Tryptisch verdaute Proteine wurden mit Hilfe der nano-HPLC aufgetrennt und mit Hilfe des ESI-MS-Geräts analysiert. Bei den untersuchten Proben handelte es sich dabei im wesentlichen um Proteine, die im Infektions- oder Entzündungsprozess eine Rolle spielen, wie z.B. RelA (das im Zuge der Adaptation des prokarytischen Metabolismus und seiner Genexpression bei Umweltveränderungen eine Rolle spielt und als Virulenzfaktor wirkt), CPAF (eine chlamydiale Protease), zwei Fragmente von DegQ (einer Chaperon-Protease aus dem Periplasma von Legionella micdadei), PfICP (ein Cystein-Protease - Inhibitor aus Plasmodium falciparum) sowie der C- und N-terminalen Domäne des Mip-Proteins (macrophage infectivity potentiator, eines essentiellen Virulenzfaktors) aus Legionellen und Chlamydien. Da diese Proteine teilweise instabil sind, wurden neben den nativen Proteinen auch Degradationsprodukte untersucht, um den Abbau genauer charakterisieren zu können (C-terminal, N-terminal oder Schnittstellen innerhalb des Proteins). Ferner konnten auch Domänengrenzen mit ESI-MS bestimmt werden. Die Sequenzabdeckung erreichte dabei in einigen Fällen Werte von über 60%, was eine eindeutige Identifizierung ermöglichte. Messungen von Proben aus anderen Instituten der Universität Lübeck i) Institut für Chemie: In Zusammenarbeit mit Frau Dr. Hanne Peters wurde das Molekulargewicht des peracetylierten Zuckers 2-Deoxy-2-N-13C-Acetyl- 1,3,4,6-tetra-O-acetyl-ß-D Glucopyranose und seiner Vorstufen überprüft. Ferner wurden Untersuchungen zur Dimerisierung der Galaktosyltransferasen GTA und GTB durchgeführt. In Zusammenarbeit mit Herrn Prof. Karsten Seeger wurde die Größe der Domäne A2 des von Willebrand-Faktors bestimmt. ii) Klinik für Dermatologie und Venerologie: In Zusammenarbeit mit Herrn Prof. Ralf Ludwig wurde die Größe von Proteinen gemessen, die an der Immunmodulation beteiligt sind. iii) Institut für Physik: In Zusammenarbeit mit Herrn Prof. Dr. Christian Hübner wurde die Größe verschiedener Fluoreszenz-markierter Proteine bestimmt. iv) Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene: In Zusammenarbeit mit Herrn Prof. Dr. Jan Rupp wurde versucht, Proteine der Einschlußmembran von Chlamydien zu identifizieren.