Development of fast multi-photon microscope for kHz-imaging of in vivo neuronal network activity

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Project Details

Description

Two-Photon microscopy (TPM) enables high-resolution, 3-D imaging of the brain. TPM is already widely used for the study of degenerative diseases like Alzheimer´s and dementia. However, in order to study neural activity and disease-related modifications of whole neural networks, the images must be obtained at high frame rates. The synaptic information transport occurs at the millisecond and sub-millisecond timescale, so kHz frame-rates are desired. This was already achieved with one-photon microscopy (FIRE microscope) in the group of Prof. Bahram Jalali at the University of California Los Angeles (UCLA). The aim of this DFG research proposal is the development of a fast TPM system, thus enabling much higher imaging depth in tissue at high resolution. By employing fast lasers in combination with a time-encoded imaging technique, pixel rates of 100 MHz and frame rates of 1.5 kHz at 256x256 pixels shall be reached. In order to accomplish this, the signals will be generated using advanced modulation techniques paired with the detection of the two-photon signals by highly sensitive photomultiplier tubes (PMT). PMTs have time-resolutions of sub-ns and are thus also suited for fluorescence lifetime imaging (FLIM) in parallel. This would also lead to a dramatic increase of FLIM imaging speeds by the proposed system. Over all, the envisaged multi-modal microscope would yield a speed enhancement of more than a factor of 10 as compared to conventional TPM systems and is thus suited for application in imaging of neural networks in vivo at time-resolutions intrinsic to axon potential spiking events.

Key findings

Im Zuge dieses Forschungsstipendiums wurde ein neuer Laser entwickelt, der sehr schnelle nichtlineare Mikroskopieaufnahmen ermöglicht. Der sogenannte Fourier-Domänen Modengekoppelte-Master-Oscillator-Power-Amplifier (FDML-MOPA) Laser erzeugt eine Abfolge wellenlängendurchgestimmter kurzer Pulse, die eine hohe Spitzenleistung aufweisen. Durch Ablenkung an einem Beugungsgitter kann so ein passives Zeilenscanverfahren realisiert werden, welches Zeilenscangeschwindigkeiten von 342 kHz erreicht. Der neuartige Laser wurde für die Zweiphotonenmikroskopie angewandt, wobei sowohl Fluoreszenz als auch die Fluoreszenzlebenszeiten gleichzeitig gemessen wurden. Eine mögliche Anwendung dieses sogenannten "Spectro-temporal Lifetime Imaging by Digitally sculpted Excitation" (SLIDE)-Mikroskops ist die Zweiphotonenmikroskopie in der neuronalen Bildgebung von Mäusen. Es gibt erste Ergebnisse von Mäusegehirnen mit genetisch enkodiertem tdTomato Fluoreszenzprotein. Die Bildwiederholrate des Zweiphotonenmikroskops liegt bei 2kHz für Bildgrößen von 256 x 170 Pixeln. Somit wird nur ein einziger Anregungspuls pro Pixel bei Pixelraten von 88 MHz verwendet. Als weitere Anwendung dieser schnellen Bildaufnahmegeschwindigkeiten wurde die Durchflusszytometrie untersucht. Hier wurden bei Flussgeschwindigkeiten von 0,2 m/s einige Tausend Zellen pro Sekunde beugungsbegrenzt bildgebend gemessen und sub-zelluläre Strukturen mittels Zweiphotonenmikroskopie und Fluoreszenzlebenszeitmikroskopie (FLIM) hochaufgelöst dargestellt. Weiterhin wurde der FDML-MOPA Laser frequenzverdoppelt zu 532 nm, sodass auch ein Einsatz in der Einphotonenfluoreszenzmikroskopie betrieben werden konnte. Es wurden Bildaufnahmegeschwindigkeiten für Fluoreszenzbildgebung und FLIM von sehr schnellen 2kHz erreicht. Zuletzt wurde der FDML-MOPA Laser noch für schnelles LIDAR eingesetzt. Durch eine time-of-flight Messung der Anregungspulse konnte eine dreidimensionale räumliche Vermessung mittels Nahinfrarotem Licht mit 2kHz Aufnahmegeschwindigkeiten erreicht werden. Dieser neuartige Laser ist faserbasiert, was neben einem robustem Aufbau einen zukünftigen endoskopischen Einsatz von SLIDE vielversprechend erscheinen lässt. Dieser endoskopische Einsatz, die Bildgebung von neuronaler Aktivität und die Anwendung in der Durchflusszytometrie sollen im Anschluss an dieses Forschungsstipendium weiter und tiefergehend untersucht werden.
Statusfinished
Effective start/end date01.01.1631.12.18

UN Sustainable Development Goals

In 2015, UN member states agreed to 17 global Sustainable Development Goals (SDGs) to end poverty, protect the planet and ensure prosperity for all. This project contributes towards the following SDG(s):

  • SDG 9 - Industry, Innovation, and Infrastructure

Research Areas and Centers

  • Academic Focus: Biomedical Engineering

DFG Research Classification Scheme

  • 201-02 Biophysics
  • 308-01 Optics, Quantum Optics, Atoms, Molecules, Plasmas

Fingerprint

Explore the research topics touched on by this project. These labels are generated based on the underlying awards/grants. Together they form a unique fingerprint.