CRU 126, Subproject: NMR studies on the molecular basis of the pull principle in the astrocyte-neuron shuttle

Neuste Untersuchungen haben enge metabolische Verknüpfungen zwischen Astrozyten und Neuronen zutage treten lassen. Besonders interessant ist, dass diese Interaktionen vermutlich durch ein Puil-Prinzip determiniert sind. Dennoch sind die biochemischen Grundlagen des Flusses der metabolischen Energie unter physiologischen Bedingungen bisher nicht geklärt. Insbesondere ist unbekannt, welche metabolischen Schritte den Pull-Mechanismus kontrollieren. NMR-spektroskopische Experimente unter Verwendung isotopenangereicherter Substrate sind ein wirksames Instrument, um das Schicksal metabolischer Spezies in Zellextrakten und Überständen zu verfolgen. In diesem Projekt sollen die Schlüsselschritte bei der Regulierung des Astrozyten-Neuronen Shuttle identifiziert werden, und es soll ein Modell zur Vorhersage des Verhaltens dieses Systems unter verschiedenen physiologischen Bedingungen entwickelt werden. Durch den Vergleich mit dem metabolischen Grundzustandsprofil sollen dann die regulatorischen Schritte des Pull-Mechanismus identifiziert werden. Die experimentellen Daten sollen schließlich dazu dienen, spezifische metabolische Modelle im Z-Projekt zu entwickeln. Wir glauben, dass unsere Ergebnisse nicht nur der Klärung des Pull-Mechanismus dienen, sondern darüber hinaus neue Therapieansätze im Bereich der Adipositas ermöglichen.

Ziel des Teilprojektes B1 war es zu untersuchen, inwieweit äußere Stimuli den Metabolismus von Neuronen und Astrozyten beeinflussen und so möglicherweise das Pull-Prinzip aus der Selfish Brain Theorie auf molekularer Ebene widerspiegeln. Bei den ersten Untersuchungen sind wir von einer neuronalen Zelllinie (HT22-Zellen) ausgegangen. Unsere ersten Experimente haben uns schnell erkennen lassen, dass eine bestimmte Klasse von Metaboliten bisher bei der Untersuchung des Metabolismus von Neuronen und Astrozyten, aber auch von anderen Zellen, vollkommen vernachlässigt worden war. Es handelt sich hierbei um die sog. aktivierten Zucker, die über den Hexosaminbiosyntheseweg gebildet werden. Eine zentrale Rolle spielt hierbei der Metabolit UDP-GlcNAc, ein Molekül, an dem verschiedene Stoffwechselwege zusammenlaufen und NMR-spektroskopisch durch C13-Markierung sichtbar gemacht werden können. Von besonderer Bedeutung ist dabei, dass die Signale dieser aktivierten Zucker in einem spektralen Fenster in Resonanz treten, in dem nahezu keine Überlagerung mit anderen Metaboliten zu beobachten ist. Wir haben daher frühzeitig unseren Fokus auf die Untersuchung der Konzentration der aktivierten Zucker unter verschiedenen Bedingungen gerichtet und konnten zeigen, dass man durch Labeling der Zellen mit 1-C13-Glucose unter Beobachtung der Signale des UDP-GlcNAc - entweder in C13-gefilterten Protonenspektren oder in 1D-HSQC-Spektren - direkt sichtbar machen kann, ob der Zitronensäurezyklus zusätzlich zum Hexosaminbiosyntheseweg in einer Zelle „angeschaltet“ ist. Wir haben dies durch den Zusatz von Stoffen, die die oxidative Phosphorylierung hemmen, wie Azid oder Rothenon, erreicht. Diese schönen Ergebnisse haben uns ermutigt, in dieser Richtung weiterzuarbeiten und wir haben uns zunächst mit der Optimierung der Aufarbeitung neuronaler Zellen beschäftigt. Dabei hat sich herausgestellt, dass die in der Literatur überwiegend genutzte Methode der PCA-Extraktion antioptimal ist, da eine Reihe von Metaboliten, dabei insbesondere aktivierte Zucker, irreversibel zerstört werden und so in metabolischen Profilen nicht mehr nachweisbar sind. Wir konnten zeigen, dass dies zu falschen Schlüssen hinsichtlich des Zellmetabolismus führen kann und haben für unsere Bedingungen eine Chloroform-Methanol-Extraktionsmethode optimiert. In der Zwischenzeit haben sich aus der Kollaboration der Laboratorien Jöhren und Pellerin interessante Ergebnisse hinsichtlich der Regulierung des Hypoxie-induzierenden Faktors HIF durch NO ergeben. Wir haben daher mit NMR an Astrozytenprimärzellkulturen den Einfluss von Stickstoffmonoxid auf die Konzentration der aktivierten Zucker untersucht. Diese Experimente sind derzeit noch nicht abgeschlossen und sollen mit den Expressionsprofilen, insbesondere der am Hexosaminbiosyntheseweg beteiligten Enzyme, abgeglichen werden. Die einfache Untersuchbarkeit und Möglichkeit der Quantifizierung der aktivierten Zucker durch 1H-NMR-Spektroskopie gibt uns jetzt die Möglichkeit, sehr schnell und einfach den Einfluss verschiedenster Stimuli auf den Metabolismus von Neuronen und Astrozyten zu untersuchen. Unsere laufenden Experimente zeigen, dass hier noch sehr spannende Ergebnisse zu erwarten sind. Aktuell bearbeiten wir derzeit beispielsweise die Frage, welchen Einfluss das β-amyloide Peptid auf den Stoffwechsel aktivierter Zucker in primären Astrozyten hat.