Binding of a cellular chaperone to proteases of different viruses - interaction determinants and significance for viral replication

Die Replikation von positiv-Strang RNA Viren umfasst die Translation von Polyproteinen, die durch zelluläre und virale Proteasen prozessiert werden. Für Pestiviren konnten wir zeigen, dass ein zelluläres Protein als Kofaktor einer essentiellen Protease (NS2 Protease) fungiert und hierüber die virale Replikation maßgeblich beeinflusst. Das zelluläre Protein ist ein Chaperon aus der Familie der J-Domänen-Proteine. Unsere aktuellen Arbeiten zeigen, dass dieses zelluläre Protein auch an Proteasen andere iv-Strang RNA Viren bindet. Von besonderem Interesse ist die Bindung an die NS2-3-Protease des humanen Hepatitis C Virus (HCV). Eine Interaktion wurde aber auch mit der NS2B-3-Protease des Gelbfiebervirus (GFV) sowie der 2A-Protease des Poliovirus (PV) nachgewiesen. Im Rahmen dieses Antrags sollen die Interaktionen des Chaperons mit der HCV NS2-3-Protease im Detail charakterisiert werden. Eines der Ziele ist die Ermittlung eines Konsensusmotivs für Bindungspartner des Chaperons; dies könnte zur Identifikation weiterer Bindungspartner des Chaperons in anderen Virussystemen führen. Von zentralem Interesse sind Effekte der Chaperon/Protease Interaktionen auf HCV-Replikation, Proteaseaktivität, sowie auf die Virus/Wirt Interaktion. Eine signifikante Rolle eines Wirtsproteins für HCV wäre von Bedeutung für Wissenschaft und Wirkstoffforschung.

Wirtsfaktoren mit einer kritischen Rolle in der viralen Replikation stellen ein interessantes Arbeitsgebiet dar. Das Verständnis ihrer Funktion kann zudem zu neuartigen therapeutischen Ansätzen führen, welchen die Viren durch Mutation nur schwer ausweichen können. Obwohl die Viren des Genus Flavivirus mit Vertretern wie dem Dengue Virus aktuell eine der relevantesten Gruppen humanpathogener Erreger darstellen, gibt es gegen diese Viren keine spezifischen Virostatika. Für Dengue Virus gibt es nach wie vor auch keinen Impfstoff, der gegen alle vier Serotypen zuverlässig Schutz vermittelt. Daher sind Untersuchungen zu neuartigen antiviralen Strategien von Bedeutung. Im abgeschlossenen Projekt wurde die Rolle des zellulären Proteins DNAJC14 in der Replikation von verschiedenen Vertretern der Familie Flaviviridae untersucht. Vorausgehende Arbeiten hatten gezeigt, dass dieses Protein essentiell für die Replikation der Pestiviren (Genus Pestivirus) ist. Eine Überexpression dieses Proteins führte hingegen beim Gelbfiebervirus (GFV; Genus Flavivirus) zu einer massiven Inhibition. Weitere Arbeiten zeigten, dass dieser Effekt bei einer Vielzahl von Flaviviren, wie z.B. Dengue Virus, Frühsommer-Meningoenzephalitis Virus, West Nil Virus und „Japanese encephalitis“ Virus, auftritt. In den in diesem Projekt durchgeführten Arbeiten zeigte sich, dass die Überexpression von DNAJC14 zu einer Hemmung auf Ebene der RNA Replikation führt, da sie auch nach Elektroporation von GFV Replikon-RNA zu beobachten war. Die getesteten DNAJC14 Mutanten/Fragmente zeigten, dass die Proteindomäne, welche für die Förderung der pestiviralen Replikation ausreichend ist, nicht zur Hemmung der Flavivirusreplikation in der Lage ist. Somit legen die erhaltenen Daten nahe, dass die beiden Phänomene, Förderung der Pestivirus-Replikation/ Hemmung der Flavivirusreplikation auf unterschiedlichen Mechanismen beruhen. Diese Arbeit lieferte keinen Hinweis auf eine spezifische Interaktion von DNAJC14 mit einem der getesteten flaviviralen Proteine, was eventuell Rückschlüsse auf den Mechanismus der Hemmung ermöglicht hätte. Es zeigte sich keine Hemmung der flaviviralen NS2b/NS3 Protease durch die DNAJC14 Überexpression. Das Auftreten von Virusmutanten, die resistent gegenüber dem Effekt der DNAJC14 Überexpression waren, wurde in Zellkultur nicht beobachtet. Somit scheint dieser Effekt dominant zu sein. Für eine therapeutische Nutzung müsste aber das zugrunde liegende Wirkprinzip bekannt sein, was sich aufgrund der Komplexität als sehr schwierig herausgestellt hat. Im humanen System sind bislang keine Zellen bekannt in welchen ein DNAJC14-Expressionsniveau erreicht wird, welches zu einer Hemmung der Flavivirusreplikation ausreichen würde. Somit ist die biologische Relevanz der beobachteten Hemmung im humanen System ungewiss. Für das Gelbfiebervirus stellen Moskitos einen essentiellen Wirt dar. Daher zielen aktuelle Untersuchungen auf die Untersuchung der Rolle des DNAJC14 Orthologs in Aedes aegypti Zellen. Der zweite Teilbereich des Projekts hat neue Details zur Regulation der NS2-NS3 Protease des HCV aufgezeigt. Diese Analysen werden weitergeführt. Die Arbeiten verlaufen weiterhin vielversprechend und lassen auf einen neuartigen Aktivierungsmechanismus der NS2 Protease durch NS3 schließen.