Transientenkinetische Analyse des Nukleotid-Selektionsmechanismus von DNA-Polymerasen mit Hilfe sterischer Sonden

Das vorgeschlagene Projekt soll weitergehende Erkenntnisse hinsichtlich molekularer Mechanismen der intrinsischen Substratspezifität von DNA-Polymerasen liefern. Hierzu sollen vergleichende Untersuchungen transientenkinetischer Parameter des Nukleotideinbaus verschiedener DNA-Polymerasen und entsprechender Mutanten aus unterschiedlichen Organismen und Polymerasefamilien durchgeführt werden. Von besonderem Interesse ist hierbei der Einsatz modifizierter Nukleotide als sterische Sonden. Im Gegensatz zu beschriebenen Modifikationen, die üblicherweise an der Base lokalisiert sind, sollen hier Modifikation an der 4´Position des Zuckers verwendet werden. Durch Variation der Länge von bestimmten Alkylsubstituenten kann dabei der Platzbedarf des Nukleotids in der Bindungstasche einer Polymerase sukzessive erhöht werden, und somit wichtige Erkenntnisse betreffend einer möglichen Korrelation geometrischer Parameter und der Substratspezifität, sowie der Rolle des Zuckers bei der Nukleotidselektion, gewonnen werden. Entsprechende Voruntersuchungen zeigen nachhaltig die Zweckmäßigkeit dieses Ansatzes, wie durch entsprechende Publikationen belegt. Auf diesen Erkenntnissen aufbauende Studien, lassen weitergehende Einsichten hinsichtlich molekularer Mechanismen der variierenden Substratselektivität von DNA-Polymerasen erwarten.

Grundsätzlich ist festzustellen, die im Rahmen des vorliegenden Projekts gewonnenen experimentellen Daten spiegeln wider was man basierend auf der zugrundeliegenden Theorie einer möglichen Korrelation geometrischer Parameter des aktiven Zentrums der Polymerase und der Substratspezifität erwarten würde; d.h. einerseits je genauer eine Polymerase und andererseits je größer der Platzbedarf des Nukleotids ist (hierbei ist es zumindest was den allgemeinen Trend anbelangt letztlich unerheblich ob es sich um das einzubauende Nukleotid, ein Nukleotid am Primer-Ende oder ein Nukleotid im Template-Strang handelt), desto stärker wird diskriminiert (Pfu > RTM184V > RTwt > Dbh / TiPrTP > TETTP > TMETP > THTP). Die molekularen Mechanismen, die zu den beobachteten Diskriminierungen führen, sind allerdings sehr unterschiedlich und abhängig von der biologischen Funktion der jeweiligen Polymerase. Interessanterweise gibt es auch Abweichungen von dieser generellen Regel: korrekte Verlängerung eines TMe-modifizierten Primers bzw. Einbau von ATP gegenüber TEtTP durch Dbh, falsche Verlängerung eines TMe-modifizierten Primers durch RTM184V bzw. Pfu und Verlängerung eines TEt-modifizierten Primers durch RTM184V. Die Gründe für diese Abweichungen sind derzeit nur unvollständig verstanden und deren Aufklärung bedarf weiterer Untersuchungen. Interessanterweise ist die Diskriminierung während der initialen Nukleotidbindung moderat mit einem Faktor von bestenfalls 10-fach für korrekten als auch falschen Einbau. Im Fall der Dbh ist keine Diskriminierung während des Bindungsschritts zu beobachten; im Gegenteil die Affinität zu modifizierten Nukleotiden ist sogar bis zu 5-fach erhöht. Folglich spielt die Substratbindung nur eine untergeordnete Rolle im Kontext Substratspezifität. Die beobachtete Selektivität der beiden replikativen Polymerasen Pfu und HIV-1 RT für die natürlichen versus alkylierten dNTPs von bis zu 106-fach ist höchstwahrscheinlich auf eine kinetische Partitionierung der konformatiellen Intermediate zurückzuführen (i.e. Gleichgewicht zwischen offener bzw. geschlossener Konformation des ternären Komplexes; Rate der Rückreaktion > Rate des chemischen Schritts). Dies hat zur Folge, dass alkylierte Substrate schneller dissoziieren als eingebaut zu werden. Weiterhin wäre vorstellbar, dass korrekte bzw. falsche Substrate unterschiedliche konformationelle Umlagerungen triggern, die zu einer erhöhten Selektivität während des korrekten Einbaus führen könnten. Gänzlich anders verhält es sich bei der Bypass-Polymerase Dbh. Hier ist eine deutliche Verlangsamung des chemischen Schritts zu beobachten, der auf inkorrekt positionierte Substrate als Ergebnis eines flexibleren aktiven Zentrums zurückzuführen ist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass mit der vorliegenden Studie die wesentlichen im Antrag formulierten Fragen zu großen Teilen beantwortet werden konnten. Um die oben angesprochene kinetische Partitionierung als Mechanismus der Substratspezifität replikativer Polymerasen experimentell zu untermauern, wäre es erforderlich, in weiterführenden Untersuchungen die entsprechenden Rückreaktionen zu bestimmen. Zusätzliche Erkenntnisse würden hochaufgelöste Röntgenstrukturen der jeweiligen Komplexe liefern.