In-vivo-Bildgebung und optische Manipulation lebender Dünndarmschleimhaut durch 2-Photonenmikroskopie und Femtosekunden-Laserchirurgie

In der ersten Förderperiode wurden erfolgreich neue Methoden zur intravitalen 2-Photonenmikroskopie auf Basis von Gewebsautofluoreszenz etabliert. Im Mausmodell wurden an der Darmschleimhaut umfangreiche Erkenntnisse zu dynamischen Aspekten der Epithelzellbiologie und Schleimhaut-Immunologie gewonnen. Es wurde erstmals die Dynamik intraepithelialer Lymphozyten beobachtet und deren in-vivo-Kinetik quantifiziert. Durch Einkopplung eines UV-Manipulationslasers und Entwicklung einer Online-Dosimetrie wurden Voraussetzungen geschaffen, lokal Gewebsschäden zu setzen und Reaktionen in-vivo zu verfolgen. In der Fortsetzung soll die Bildgebung auf den längeren IR-Bereich ausgedehnt, mit mehreren Wellenlängen quasi-simultan angeregt werden, die Fokusqualität durch adaptive Optik verbessert und eine durch integrierte Blasen-Interferometrie kontrollierte Laser-Nanochirurgie entwickelt werden. Mit diesen neuen Bildgebungsmöglichkeiten sollen Mechanismen der Lymphozytenmigration und Antigenprozessierung im Epithel aufgeklärt und durch kontrollierte Lasermanipulation ein besseres Verständnis von Schadensmechanismen in biologischen Geweben erreicht werden. Die veränderte Dynamik bei entzündlichen Erkrankungen soll erforscht werden, indem ein Entzündungsmodell für die Dünndarmschleimhaut etabliert, die Invasion von Bakterien verfolgt und die Bewegung von Immunzellen und die Regeneration nach Gewebsschädigung beobachtet werden.

Ziel der interdisziplinären Zusammenarbeit von Medizinern und Physikern war es, aktuelle Möglichkeiten mikroskopischer Bildgebung und optischer Manipulation mit zellbiologisch-immunologischen Untersuchungen an der Darmschleimhaut zu verbinden. Als zentrale Methode wurde die 3D-Mikroskopie mittels Kurzpuls-Lasern auf ein neues in-vivo-Mausmodell angewendet. Hierzu standen mehrere 2-Photonenmikroskope z.T. mit eingekoppelten Manipulationslasern zur Verfügung. Insgesamt konnte das Projekt erfolgreich realisiert werden. Das Arbeitsprogramm wurde in der Mehrzahl der projektierten Punkte umgesetzt, die Mehrzahl der Ziele wurde erreicht und die Ergebnisse wurden umfassend publiziert. Für einen kleinen Teil der experimentellen Ansätze ergaben sich zur Laufzeit methodische Schwierigkeiten, u.a. für die Untersuchungen pathologisch veränderter Darmschleimhaut. Für andere Aspekte, wie die Nutzung der mikroskopischen optischen Kohärenztomographie (m-OCT) oder die in-vivo-Migration von Lymphozyten im Darmepithel, ergaben sich dagegen unerwartete Befunde, die zu inhaltlichen und methodischen Erweiterungen führten. Die methodischen Aspekte des Projekts umfassten die multispektrale Detektion mit erweiterter Infrarot-Bildgebung. Hier wurden für verschiedene Abbildungsmodi (Autofluoreszenz, Farbstoffe, IR, FLIM, SGH, THG) optimierte Parameter ermittelt, um bei minimierten phototoxischen Schäden über möglichst lange Beobachtungszeit spezifische Gewebekomponenten sowie eingebrachte Marker lokalisieren zu können. Dies wurde durch kombinierte Detektion endogener Chromophore und bis zu 3 eingebrachter Farbstoffe erreicht. Zusätzlich wurde die neue Methode der m-OCT in eines der Geräte integriert und erfolgreich zur 3D-Übersichtsmorphologie eingesetzt. Es wurde systematisch nach geeigneten Farbstoffen für 2-Photonenanregung und simultane Detektion von bis zu 4 Signalen gesucht. Zur Verbesserung der Bildqualität bei gekrümmten Gewebsoberflächen wurden adaptive Optiken sowie Methoden zur dynamischen Kompensation des Wellenfrontfehlers entwickelt und erprobt. Zur Erweiterung des Methodenspektrums für die Laser-Nanochirurgie wurden zwei Verfahren etabliert und getestet, mit denen einzelne Zellen des lebenden Darmepithels gezielt zerstört werden können, um migratorische, inflammatorische und regenerative Prozesse bildgebend zu verfolgen. Hierzu wurde ein UV-Dissektionslaser und ein cw-Probenlaser zur Online-Dosimetrie in Rückstreuung in den Fluoreszenz-Detektionsstrahlengang des Mikroskops eingekoppelt, um Radius- Zeitkurven der Blasenoszillation zu rekonstruieren. Diese optischen Methoden wurden auf ein im Rahmen des Projekts entwickeltes in-vivo-Mausmodell angewendet, das es erlaubt, unter kontrollierten Bedingungen 3D-Zeitserien der lebenden Dünndarmschleimhaut über bis zu 8 h aufzuzeichnen. Bewegungsartefakte und Bildrauschen konnten durch speziell entwickelte Algorithmen auf ein Minimum reduziert werden. In diesem Modell wurde die Aufnahme der Tracer UEA-I und OVA über die M-Zellen der Peyer-Plaques in vivo charakterisiert und das Zusammenwirken mit den Fortsätzen von Makrophagen und dendritischen Zellen räumlich verfolgt. In M-Zellen wurden transzelluläre Poren gefunden, durch die nicht nur die Fortsätze dendritischer Zellen, sondern auch CD45+ B-Lymphozyten direkt das Darmlumen kontaktieren. Die Bewegungsmuster von migrierenden Lymphozyten in den Zotten des Darmepithels wurden quantifiziert, und es wurde ein mathematisches Modell für die engmaschige Kontaktierung der Epithelzellen durch Lymphozyten entwickelt. Nach Lasermanipulation einzelner Epithelzellen wurden die Regenerationsvorgänge des Zellverbands sowie Immunantworten in vivo verfolgt. U.a. wurden Zusammenhänge zwischen Pulslänge, Anregungswellenlänge, Blasengröße und Schadensmechanismen analysiert und die Einwanderung von Granulozyten innerhalb weniger Minuten als Reaktion beobachtet.