Analyse der Heterogenität von Tumor-initiierenden Zellen in Hepato-biliären Tumoren - Molekulare Charakterisierung und therapeutisches Abzielen auf (Krebs-)Stammzell-Eigenschaften

Primäre Lebertumore (PLCs) gehören zu den bösartigsten Tumoren weltweit und zeigen eine steigende Inzidenz in der westlichen Welt. In der überwiegenden Mehrzahl der Fälle besteht eine chronisch-entzündliche Lebererkrankung, die ein pro-onkogenes Mikromilieu in der Leber erzeugt und somit die Entwicklung von Leberkrebs prädisponiert. In Abhängigkeit von dem zellulären Ursprung der malignen Transformation entwickelt sich ein breites Spektrum an verschiedenen morphologischen und molekularen Phänotypen, welches generelle therapeutische Strategien für PLCs beeinträchtigt. In diesem Zusammenhang stellt die sog. Krebsstammzell-Hypothese ein plausibles Erklärungsmodell für die beobachtete Tumor-Heterogenität dar. Entsprechend der Hypothese ist ein Abzielen auf molekulare Krebsstammzell-Mechanismen für die definitive Eradikation von PLCs notwendig und erfordert ein detailliertes Verständnis der molekularen Schlüsselcharakteristika von Leberkrebsstammzellen. In dem hier vorgestellten Projekt werden wir uns auf verschiedene Aspekte der Krebsstammzell-Biologie in PLCs konzentrieren. Neben der intra-tumoralen Krebsstammzell-Heterogenität, sollen die prospektive Isolierung, sowie das therapeutische Abzielen auf Krebsstammzellen im Vordergrund stehen. Zunächst werden wir ein robustes und reproduzierbares in vitro-Modell für PLCs entwickeln, welches die individuellen phänotypischen und molekularen Eigenschaften von PLCs wiederspiegeln. Anschließend werden wir dann prospektiv aufgereinigte Krebsstammzellen aus humanen PLCs isolieren und mittels Next-Generation Transkriptom-Sequenzierung analysieren, um übergeordnete molekulare Merkmale der Krebsstammzellen zu identifizieren sowie deren prognostische Bedeutung zu beschreiben. Anschließend werden wir das therapeutische Potenzial der identifizierten Signalwege für krebsstammzell-gerichtete Therapieansätze mittels zielgerichteter Therapie und RNAi bewerten. Nach erfolgreicher Selektion der aussichtsreichsten Ziele werden wir die Anwendbarkeit dieses Ansatzes für andere solide Tumoren sowie Lebermetastasen von verschiedenen Primärtumoren testen. Abschließend werden wir den Einfluss des Tumor-Mikromilieus für die Heterogenität der von Krebsstammzellen in PLCs analysieren. Hierfür sollen die molekularen Profile von isolierten Krebsstammzellen aus verschiedenen intra-tumoralen, peri-tumoralen und nicht-tumorösen Regionen vergleichen. Ziel dieser Untersuchungen ist es detaillierte Erkenntnisse über die molekularen Eigenschaften von Krebsstammzellen in PLCs zu gewinnen und das Potenzial von Krebsstammzell-gerichteten Therapieansätzen als Ergänzung für bestehende Therapien in PLCs zu beschreiben.

Hepatocellular carcinoma (HCC) and cholangiocarcinoma (CCA) are two major types of primary liver cancers (PLC). PLCs rank among the deadliest cancers worldwide with poor clinical outcome. Absence of clinical symptoms and effective biomarkers for early detection are main causes of late diagnosis and detrimental prognosis. Therefore, identification of potentially druggable targets and subsequent development of next-generation targeted therapies, as well as translation of these findings into clinical practice remain crucial. To further govern translational advancements, development of primary culture models that closely recapitulate phenotypic and molecular diversities as well as the cell of origin, i.e. putative cancer stem cell (CSC), of PLC is urgently needed in order to support a translation from laboratory studies to the bedside and improve patient outcome. Major obstacle still represents a lack of models that truly and accurately represent morphological and molecular heterogeneity of original tumors. As an integral part of the here presented project, we report successful establishment and detailed characterization novel patient-derived primary liver cancer cell lines (PPCL) from HCC and intrahepatic CCA. The model was subsequently utilized to address and modulate important aspects of CSC biology in PLC. Morphologic and phenotypic characteristics of newly established cell lines were compared to original tumors and confirmed a high level of similarity. Tumor grading and genomic stability were further assessed to determine background setting for successful PPCL establishment. Our results provide evidence that less differentiated tumors with higher genomic instability possess a higher likelihood of successful PPCL establishment. Time course analyses of selected CSCs markers as well as transcriptomic and genomic changes were performed using FACS as well as nextgeneration sequencing (NGS) to characterize and generate molecular profiles of newly derived PPCL and investigate how accurately they recapitulate original cancer tissue. Analyses confirmed that PPCL retain similar profile as corresponding primary tumors during long-term culturing. Key oncogenic alterations were identified by targeted NGS (e.g. TP53, KRAS, CTNNB1, MET) and cell lines carrying potentially actionable mutations were treated with corresponding specific inhibitors. Overall, our integrative analyses demonstrate that PPCLs represent refined model for discovery of relevant molecular subgroups and exploration of precision medicine approaches for the treatment of primary liver cancer and modulation of putative CSCs.