Entwicklung von schnellstem Multiphotonen Mikroskop zur in vivo Bildgebung von Aktivität in neuronalen Netzwerken

Zwei-Photonen Mikroskopie (TPM) ermöglicht hochauflösende 3-D Bildgebung und findet bereits breiten Einsatz bei der Erforschung von degenerativen Krankheiten im Gehirn wie Alzheimer und Demenz. Hierbei wäre es wichtig, die neuronale Aktivität und krankheitsbedingte Veränderungen ganzer, großflächiger neuronaler Netzwerke mit systemrelevanter Zeitauflösung zu untersuchen. Hier findet die synaptische Informationsweiterleitung auf Millisekunden bis sub-Millisekunden Zeitauflösung statt. Diese Bildwiederholungsraten im kHz-Bereich wurden mit Ein-Photonenfluoreszenzmikroskopie bereits in der Gruppe von Prof. Jalali (FIRE-Mikroskop) gezeigt. Ziel dieses Forschungsvorhabens ist es, diese Geschwindigkeit auch mit TPM zu erreichen, wobei wesentlich höhere Eindringtiefen und stark verbesserte axiale Auflösung erreicht werden. Durch schnelle Laser und zeitkodierte Bildaufnahme werden Pixelraten bis zu 100 MHz und damit Bildraten von 1.5 kHz bei 256x256 Pixeln erreicht. Um dies zu erreichen, sollen fortschrittliche Modulationsverfahren entwickelt und die Zwei-Photonen Signale mit hochsensitiven Photomultipliern (PMT) detektiert werden. PMTs besitzen sub-ns Zeitauflösung und wären damit prinzipiell auch geeignet parallel Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebung (FLIM) aufzunehmen und damit auch hier um Größenordnungen höhere Geschwindigkeit zu erzielen. Solch ein multi-modales Mikroskop wäre mehr als 10-mal schneller als bisherige TPM und könnte damit tieferen Einblick in schnellablaufende biologische Abläufe liefern und die Entwicklung neuer bildgebender Systeme vorantreiben. Ziel dieses Forschungsvorhabens ist es ein solches TPM zu entwickeln und zur Bildgebung an neuronalen Netzwerken in vivo mit Axon-relevanter Zeitauflösung anzuwenden.

Im Zuge dieses Forschungsstipendiums wurde ein neuer Laser entwickelt, der sehr schnelle nichtlineare Mikroskopieaufnahmen ermöglicht. Der sogenannte Fourier-Domänen Modengekoppelte-Master-Oscillator-Power-Amplifier (FDML-MOPA) Laser erzeugt eine Abfolge wellenlängendurchgestimmter kurzer Pulse, die eine hohe Spitzenleistung aufweisen. Durch Ablenkung an einem Beugungsgitter kann so ein passives Zeilenscanverfahren realisiert werden, welches Zeilenscangeschwindigkeiten von 342 kHz erreicht. Der neuartige Laser wurde für die Zweiphotonenmikroskopie angewandt, wobei sowohl Fluoreszenz als auch die Fluoreszenzlebenszeiten gleichzeitig gemessen wurden. Eine mögliche Anwendung dieses sogenannten "Spectro-temporal Lifetime Imaging by Digitally sculpted Excitation" (SLIDE)-Mikroskops ist die Zweiphotonenmikroskopie in der neuronalen Bildgebung von Mäusen. Es gibt erste Ergebnisse von Mäusegehirnen mit genetisch enkodiertem tdTomato Fluoreszenzprotein. Die Bildwiederholrate des Zweiphotonenmikroskops liegt bei 2kHz für Bildgrößen von 256 x 170 Pixeln. Somit wird nur ein einziger Anregungspuls pro Pixel bei Pixelraten von 88 MHz verwendet. Als weitere Anwendung dieser schnellen Bildaufnahmegeschwindigkeiten wurde die Durchflusszytometrie untersucht. Hier wurden bei Flussgeschwindigkeiten von 0,2 m/s einige Tausend Zellen pro Sekunde beugungsbegrenzt bildgebend gemessen und sub-zelluläre Strukturen mittels Zweiphotonenmikroskopie und Fluoreszenzlebenszeitmikroskopie (FLIM) hochaufgelöst dargestellt. Weiterhin wurde der FDML-MOPA Laser frequenzverdoppelt zu 532 nm, sodass auch ein Einsatz in der Einphotonenfluoreszenzmikroskopie betrieben werden konnte. Es wurden Bildaufnahmegeschwindigkeiten für Fluoreszenzbildgebung und FLIM von sehr schnellen 2kHz erreicht. Zuletzt wurde der FDML-MOPA Laser noch für schnelles LIDAR eingesetzt. Durch eine time-of-flight Messung der Anregungspulse konnte eine dreidimensionale räumliche Vermessung mittels Nahinfrarotem Licht mit 2kHz Aufnahmegeschwindigkeiten erreicht werden. Dieser neuartige Laser ist faserbasiert, was neben einem robustem Aufbau einen zukünftigen endoskopischen Einsatz von SLIDE vielversprechend erscheinen lässt. Dieser endoskopische Einsatz, die Bildgebung von neuronaler Aktivität und die Anwendung in der Durchflusszytometrie sollen im Anschluss an dieses Forschungsstipendium weiter und tiefergehend untersucht werden.