Charakterisierung funktioneller Domänen in der NS2-3-Cysteinprotease und der NS3-4A-Serinprotease des Hepatitis C-Virus sowie deren Rolle beim Assembly der viralen Replikase

Projekt: DFG-ProjekteDFG Einzelförderungen

Projektdetails

Projektbeschreibung

Das Hepatitis C Virus ist von hoher medizinischer Relevanz und ein Modell für positiv-Strang RNA Viren. Während die Serinprotease im Nichtstrukturprotein 3 (NS3) gut charakterisiert ist, sind die NS2-Cysteinprotease und deren Aktivierung durch NS3 wenig verstanden, da strukturelle Daten für ungespaltenes NS2-NS3 fehlen. Wir haben ein hydrophobes NS3 Oberflächenareal identifiziert, welches für die Aktivierung der NS2-Protease essentiell ist: Die Doppelmutation der konservierten NS3-Aminosäuren (AS) Y105 und P115 zu Alanin, interferiert mit der NS2-NS3-Spaltung, nicht jedoch mit der NS3/NS4A-Serinproteaseaktivität. Daher repliziert diese Doppelmutante im Kontext eines NS3-NS5B Replikons. Diese Austausche inhibieren aber ein NS2-NS5B Replikon, da die NS2-NS3 Spaltung für dessen Replikation essentiell ist. Somit hat der Oberflächenbereich des NS3 um AS 105/115 eine spezifische und essentielle Funktion bei der Aktivierung der NS2-Protease.Weiterhin zeigte sich, dass die NS2 Abspaltung eine Voraussetzung für die NS5A Hyperphosphorylierung darstellt. Diese NS5A Modifikation kann als Read Out für die Assemblierung einer Core-Replikase bestehend aus NS3 bis NS5A verwendet werden. Interessanterweise ist der identifizierte hydrophobe NS3 Oberflächenbereich ebenfalls kritisch für die NS5A Hyperphosphorylierung. Daraus resultiert unser Modell, dass der für die Replikase-Assemblierung als kritisch identifizierte NS3 Oberflächenbereich erst durch NS2 Abspaltung zugänglich wird.Zukünftig sollen folgende Fragestellungen untersucht werden:(i) Welcher Bereich des NS2 (im NS2-NS3) wechselwirkt mit dem identifizierten NS3 Oberflächenareal? Eine durch in silico Modeling (AG Redecke) identifizierte NS2-Oberflächenstruktur soll daraufhin experimentell überprüft werden.(ii) Wie kommt es zur Aktivierung der NS2 Protease durch NS3? Mittels in silico Modeling und Mutagenese sollen verschiedene Hypothesen zur NS3 vermittelten Änderung der NS2 Struktur überprüft werden.(iii) Lässt sich die NS2-Protease in Abwesenheit von NS3 durch Mutationen in NS2 aktivieren? Eine bereits identifizierte NS2 Mutation führt zu einer verstärkten NS2-Aktivierung in Abwesenheit von NS3. Der Mechanismus soll abgeklärt und weitere analoge NS2 Mutanten identifiziert werden. Diese NS2-Proteasemutanten sollen auf ihren Effekt in der HCV Replikation getestet werden. Dies erlaubt Rückschlüsse auf die Rolle der Regulation der NS2-Protease für den Replikationszyklus des HCV.(iv) In welchen Schritten erfolgt die Assemblierung der Replikase? Die NS3-Proteasedomäne spielt eine wichtige, unbekannte Rolle bei der NS5A-Hyperphosphorylierung und der Replikase-Assemblierung. Nach unserem Modell ermöglicht die NS2 Abspaltung die Anlagerung weiterer NS4A Bereiche an NS3. Dadurch entsteht die Plattform für die weitere Assemblierung der Replikase. Über gezielte Mutagenese sowie die Selektion von second site Revertanten soll der schrittweise Ablauf der Replikase-Assemblierung nachvollzogen werden.
Statusabgeschlossen
Tatsächlicher Beginn/ -es Ende01.01.1531.12.20

UN-Ziele für nachhaltige Entwicklung

2015 einigten sich UN-Mitgliedstaaten auf 17 globale Ziele für nachhaltige Entwicklung (Sustainable Development Goals, SDGs) zur Beendigung der Armut, zum Schutz des Planeten und zur Förderung des allgemeinen Wohlstands. Die Arbeit dieses Projekts leistet einen Beitrag zu folgendem(n) SDG(s):

  • SDG 3 – Gesundheit und Wohlergehen

Strategische Forschungsbereiche und Zentren

  • Forschungsschwerpunkt: Infektion und Entzündung - Zentrum für Infektions- und Entzündungsforschung Lübeck (ZIEL)

DFG-Fachsystematik

  • 204-04 Virologie

Fingerprint

Erkunden Sie die Forschungsthemen zu diesem Projekt. Diese Zuordnungen werden Bewilligungen und Fördermitteln entsprechend generiert. Zusammen bilden sie einen einzigartigen Fingerprint.